·產品描述

本試劑盒可以從少量的生物樣品中快速提取高質量的總RNA，不使用酚和氯仿等有毒物質。具有操作簡單快速、穩定性高、無毒的優勢。適用于細胞和組織的RNA提取，提取得到的總RNA可用于RT-PCR、qPCR、Northern blotting、cDNA文庫構建等多種實驗。本試劑盒由裂解液、清洗液、洗脫液組成，其中裂解液（Lysis Buffer）中含有強變性劑和RNA酶抑制劑，能夠迅速裂解樣品并失活RNA酶，確保操作過程中RNA的完整性。本試劑盒大致的操作過程如下：首先用裂解液裂解樣品；裂解好的樣品加入乙醇混勻即可上柱，離心去掉液體將RNA結合在柱子上；雜質在清洗過程中被有效去除；洗脫RNA并用于下游實驗。整個提取過程僅需10分鐘。

·產品組成

* 第一次使用前，須向Wash Buffer加48ml 無水乙醇

·保存方法

Elution Buffer需要分裝成小份室溫保存,其余試劑和RNA柱室溫保存（使用中謹防試劑被污染）。附贈的DNA酶收到后需置于-20 °C保存。

·使用建議

1.用于細胞樣品時建議用6孔板或35mm培養皿培養細胞，培養至合適的密度進行 RNA提取（24孔板培養的細胞培養至90%以上的細胞密度也可使用）。不建議100mm培養皿培養的細胞直接進行RNA提取，否則可能導致細胞裂解不充分或因核酸過量導致離心柱堵塞或導致基因組殘留。

2.用于組織樣品時建議用于內臟組織、腫瘤組織等，不適用于皮膚等堅韌的組織。該試劑盒可提取5x10⁴~3x10⁶個細胞或10~100mg組織的RNA，對于T細胞/B細胞等體積很小、RNA含量很低的細胞，建議增加細胞數到至少1x10⁶以上。

·操作步驟

1. 樣品裂解
1.1 對≤3x10⁶/孔的貼壁細胞：
1)吸干培養基，用適量的PBS洗1次；
2)加入500μl的Lysis Buffer，槍頭吹吸或攪拌數次，直至細胞完全裂解。轉移至EP管中，vortex 10秒鐘以充分裂解細胞；

1.2. 對＞3 x 10⁶/孔的貼壁細胞或懸浮細胞：
1)（本步適用于貼壁細胞。對于懸浮細胞，從步驟2開始操作）用胰酶消化將貼壁細胞懸浮起來；
2)取1~3x106個細胞的懸液至1.5 ml離心管，500 g離心3分鐘收集細胞；
3)去上清，離心管中留約10~20 μl PBS，輕彈離心管重懸細胞沉淀；
4)加入500 μl的Lysis Buffer，用力吹吸10次，vortex 10秒鐘，保證細胞完全裂解；

1.3 對動物組織（適用于內臟、腫瘤組織等，不適用于皮膚等堅韌的組織）：
1)【重要】切取10~100mg的組織小塊至1.5ml離心管，加入500ul PBS, 用組織勻漿機、手持勻漿儀或研磨棒磨碎組織，制成細胞懸液。組織必須充分勻漿，直至無肉眼可見的組織塊。
2)12000 rmp離心1分鐘，去除上清。離心管中留約30 μl PBS，輕彈離心管重懸細胞沉淀。
3） 吸取10~20 ul細胞懸液至1.5 ml離心管，加入500 μl的Lysis Buffer; 用力吹吸10次，vortex 10秒鐘，保證細胞完全裂解；
4） 12,000 rmp離心1分鐘，將上清轉移到新的1.5ml離心管中；此步為了去除未被裂解的組織小塊，以免后續操作堵塞離心柱。

2. 上柱/RNA提取
1)向裂解的細胞或組織中加入等體積的無水乙醇充分混勻（可能會產生沉淀,這是正常現象，繼續進行操作即可）。可將離心管顛倒幾次，或用移液器用力吹 吸10次使可能產生的沉淀分散開，然后將液體轉移至離心住上。
2)4,000 g離心1分鐘（相當于7000 rmp左右，如離心柱上仍有液體殘留可增加轉速至12,000 g離心）。

3. 柱清洗
1)向RNA柱中加入500μl的Wash Buffer，12,000 g離心1.5分鐘（離心結束后取出柱子時注意不要讓收集管內的廢液接觸到RNA柱，以免污染。可以倒掉廢液,將RNA柱裝回收集管，空管離心一次，能完全去除可能殘留的Wash Buffer）。

3)將柱子放到干凈的無RNA酶的1.5 ml離心管上，開蓋晾干2分鐘。此步驟為了徹底去除殘余的乙醇。
2)可選操作：若實驗對基因組的少量殘留極其敏感，可用試劑盒附贈的DNA酶處理，具體處理方法詳見最后一頁:［常見問題及解決方案］ 第4條。如果使用的逆轉錄試劑盒含DNA酶，則可省略本試劑盒的DNA酶處理。
3)將柱子放到干凈的無RNA酶的1.5 ml離心管上，開蓋晾干2分鐘。此步驟為了徹底去除殘余的乙醇。

4. RNA洗脫
1)在RNA柱的膜中心部位加入20~50 μl的Elution Buffer，室溫靜置2分鐘。
2)12,000g離心1分鐘（洗脫下來的RNA溶液重新加入柱中，靜置5分鐘，再次離心可提高洗脫效率，得到更多RNA）。（RNA洗脫下來后,建議置于冰上。）
3)測定洗脫的RNA濃度,以便于后續實驗使用。提取出來的RNA可立即用于后續實驗，也可保存在-80°C備用。

關于RNA濃度與純度：本試劑盒提取RNA，使用Nanodrop等微量分光光度計測定0D 260/280在1.90~2.2之間均屬正常（因不同儀器之間存在誤差，若OD比值略有超出，但上下不超過0.1，且吸光度曲線正常，則亦可接受）。經檢測，對于少量細胞樣品，使用本試劑盒提取的RNA濃度最低不低于30ng/ul即可使用。

·實驗結果

·常見問題解決方案

RNA產量過低，或用已經驗證過的引物檢測基因表達，檢測到的內參基因Ct值偏大，或無法做出正常的擴增結果。
解決辦法：
a. 檢查所使用的試劑是否受到污染：建議試劑盒開封后, 每種buffer分裝為2份每次使用時應嚴格按照規溯作，防止交叉污染。
b. 溶解好的引物應該分裝為小份凍存，以減少引物降解及降低污染的可能性。
c. 檢查操作流程是否正確，例如：
1. 除DNA酶以外的所有試劑均須室溫保存。若冷藏保存，應提前取出，溫度恢復至室溫之后方可使用。整個RNA提取的操作過程必須在室溫進行，不可置于冰上（直至洗脫離心后得到 RNA方可置于冰上），以避免其間產生不溶物堵塞離心柱；
2. Wash Buffer使用前需加入48毫升無水乙醇混勻才可使用；
3. 細胞或組織裂解產物，上柱前需要加入等體積的無水乙醇，充分混勻后加入離心柱中離心；
4. 可選步驟：若實驗對基因組的少量殘留極其敏感，可用試劑盒附贈DNA酶處理：RNA經wash buffer清洗一次后，按照每個樣品2 μl DNase + 2 μl 10x Reaction buffer加16 μl DEPC水（或Elution Buffer），混勻后加入離心柱中央，室溫放置5分鐘，然后加入 Wash Buffer清洗一次去除DNA酶，進行后續操作；
5. 洗滌時需用12,000 g高速離心充分去除Wash Buffer，然后開蓋晾干2分鐘；
6. 洗脫液的體積可以根據需要在一定范圍內調整（一般20-50μl，最少不可少于10 μl ,否則無法充分溶解RNA）,以濃度滿足后續實驗需求為宜。重復洗脫一次及延長放置時間至5分鐘均可提高RNA產量。
7. 若細胞體積較大以往采用TRIzol試劑提取RNA時需用100 mm培養皿培養細胞, 建議使用本試劑盒時仍然使用35mm培養皿培養細胞，本試劑盒最低可提取5萬個左右常規細胞的RNA（T、B細胞等體積極小的細胞除外），能滿足絕大多數逆轉錄和qPCR的實驗需要。經測試，本試劑盒最多大約可提取30μg左右的總RNA。
8. 組織勻漿應在PBS中充分研磨成細胞懸液，切勿在lysis buffer中勻漿。